Revista científica digital INSPILIP
Código ISSN 2588-0551
DOI:
10.31790/inspilip.v1i2.56
Acceso abierto
Artículo original
Citación
Franco G, et al. (2017)
Detección de genes asociados a
resistencia para isoniacida y
rifampicina en cepas de
Mycobacterium tuberculosis en
Ecuador. Revista científica
INSPILIP V. (1), Número 2,
Guayaquil, Ecuador.
Correspondencia
Greta Franco
Mail: gfranco@inspi.gob.ec
Recibido: 04/10/2017
Aceptado: 09/12/2017
Publicado: 12/12/2017
El autor declara estar libre de cualquier
asociación personal o comercial que
pueda suponer un conflicto de intereses
en conexión con el artículo, así como el
haber respetado los principios éticos de
investigación, como por ejemplo haber
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Detección de genes asociados a resistencia para isoniacida y
rifampicina en cepas de Mycobacterium tuberculosis en
Ecuador
Detection of genes associated to resistance for isoniacida and
rifampicin in cepas of Mycobacterium tuberculosis in Ecuador
Franco-Sotomayor Greta
1
, León-Benítez Margarita
2
.
1
Plataforma de genómica. Centro de Referencia Nacional de Micobacterias, Instituto Nacional
de Investigación en Salud Pública. Dr. Leopoldo Izquieta Pérez.
2
Escuela Superior Politécnica
del Litoral (Espol).
Resumen
Antecedentes: La incidencia de la multidrogorresistencia (MDR) adquirida
a drogas antituberculosas de Mycobacterium tuberculosis en el Ecuador es
aproximadamente del 27,83 %. Objetivo: Detectar las mutaciones
asociadas con la resistencia a los fármacos en cepas de M. tuberculosis
resistentes a fármacos utilizando la PCR-RFLP y PCR en tiempo real.
Materiales y métodos: En cepas de M. tuberculosis drogorresistentes (DR)
aisladas de muestras provenientes de 18 provincias del Ecuador (2006-
2012), se analizaron mutaciones en los genes rpoB y KatG que conducen a
la resistencia a rifampicina e isoniazida, respectivamente. EL ADN fue
amplificado por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), siendo luego
analizado por RFLP (40 cepas), qPCR (346 cepas).
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Resultados: Nuestros resultados demostraron
una correlación entre la resistencia fenotípica
a rifampicina e isoniazida y las mutaciones
encontradas en los genes rpoβ (91,6 %) y
katG (90,3 %) en cepas ecuatorianas de M.
tuberculosis. Conclusiones: Las mutaciones
asociadas a la drogorresistencia de aislados
del M. tuberculosis en el Ecuador fueron
similares a las reportadas en otros países.
Palabras claves: Mycobacterium
tuberculosis, MDR multidrogorresistente,
mutaciones
Abstract
Background: The incidence of multidrug-
resistance (MDR) acquired in Mycobacterium
tuberculosis antituberculosis drugs in Ecuador
is approximately 27,83 %. Objective: To
detect mutations associated with drug
resistance in drug-resistant M. tuberculosis
using PCR-RFLP and real-time PCR.
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Materials and methods: Mutations in rpoB
and KatG genes leading to resistance to
rifampicin and isoniazid, respectively, were
analyzed in isolates of M. tuberculosis (DR)
isolated from samples from 18 provinces of
Ecuador (2006-2012). The DNA was
amplified by Polymerase Chain Reaction
(PCR) and then analyzed by RFLP (40
strains), qPCR (346 strains) and Results: Our
results demonstrated a correlation between the
phenotypic resistance to rifampicin and
isoniazid and the mutations found in the rpoβ
(91, 6 %) and katG (90,3%) genes in
Ecuadorian M. tuberculosis strains.
Conclusions: Mutations associated with the
drug resistance of M. tuberculosis isolates in
Ecuador were similar to those reported in
other countries.
Key Words: Mycobacterium tuberculosis,
multidrug-resistant MDR, mutations
Introducción
La mortalidad por enfermedades infecciosas
sigue siendo una carga importante,
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especialmente en los países de bajos y
medianos ingresos. Este problema aumenta
por insuficiencia de recursos en salud pública,
largo periodo de desnutrición o diabetes
2
.
La
tuberculosis es una enfermedad infecciosa que
suele afectar a los pulmones y es causada por
una bacteria Mycobacterium tuberculosis
(MTB) que se transmite de una persona a otra
a través de gotículas generadas en el aparato
respiratorio de pacientes con enfermedad
pulmonar activa
48
y que a nivel mundial causa
8,7 millones de casos nuevos y 1,4 millones
de muertes cada año
1,2
. Surgiendo en los
últimos años cepas de M. tuberculosis
resistentes a los fármacos. La Organización
Mundial de la Salud (OMS) declaró a la
tuberculosis (TB) como una emergencia
sanitaria mundial y puso en marcha el "Global
Plan to Stop Tuberculosis"
1,3
hasta el 2015 y
desde 2016 rige la “Estrategia Fin a la TB”,
con el objetivo de poner fin a la epidemia
mundial de TB y sus indicadores importantes
a nivel mundial mencionan: Para 2035,
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reducción de la mortalidad por TB en un 95 %
en comparación con 2015. Para 2035,
reducción de la tasa de incidencia de TB en un
90 % en comparación con 2015. Para 2035,
que no haya familias que tengan que hacer
frente a gastos catastróficos debido a la TB
49
.
Según datos de la OMS
1,3
, el 17 % de las
cepas de MTB de casos nuevos y previamente
tratados son resistentes por lo menos a un
medicamento; 3,3 % de los casos nuevos y 60
% de los antes tratados son MDR (resistentes
a isoniacida y a rifampicina),
5,6
de estos el 5
% es XDR (extensivamente
drogorresistente)
5,7,8,9
, es decir, resistente a las
fluoroquinolonas (ofloxacina, ciprofloxacina,
moxifloxacin, etc.) y a drogas inyectables
(kanamicina, capreomicina, o amikacina). En el
año 2012 en el Ecuador la tasa de incidencia de
59 x 100.000 habitantes, tasa de prevalencia 98
x 100.000 habitantes y tasa de
mortalidad
10
1.8 x 100.000 habitantes
12,13
.
Se detectó 1,51 % MDR en casos nuevos y
27,83 % MDR en casos AT (antes tratados).
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Fuente: Sistema de información del
laboratorio de Micobacterias-INSPI. Datos no
publicados
11,12
.
Las mutaciones asociadas a
cepas altamente resistentes a isoniacida
(INH)
20,21,22,23
han sido encontradas con
mayor frecuencia en el codón 315 del gen
katG (76,83 % Ser→Thr). En lo que
concierne a la resistencia a rifampicina
(RFM)
24,25
se han evidenciado mutaciones en
una región de 81-pares de bases (pb) del gen
rpoB (subunidad beta de la ARN polimerasa),
llamada “hot-spot”,
21,28,29
en los codones
26,27
531 (Ser→ Leu) 37,8 526 (His→ Asp) 23 %, y
516 (Asp→Val)(9,46 %).
Nuestro país es uno de los de alta carga de
tuberculosis drogorresistente, sin embargo, la
prueba tradicional de sensibilidad a los
medicamentos anti- TB puede tardar dos y
tres meses
48
; para los casos de TB MDR /
XDR es absolutamente esencial reducir el
tiempo de detección y utilizar métodos de
diagnóstico rápido. El diagnóstico rápido de la
MDR -TB es extremadamente útil para el
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pronto establecimiento de un tratamiento
eficaz adaptado con mayor precisión en el
espectro de sensibilidad de la cepa resistente
(lo que reduce el riesgo de desarrollar
resistencia adicional a otras drogas) y
controlar la propagación de estas cepas.
Métodos diagnósticos genéticos reducen el
tiempo de diagnóstico de casos de
tuberculosis y, sobre todo, el caso de la
tuberculosis MDR. Este estudio tiene como
objetivo analizar los genes de resistencias de
cepas ecuatorianas de Mycobacterium
tuberculosis, utilizando dos técnicas
moleculares de rápida respuesta diagnóstica.
Este se constituye en el primer estudio en
cepas ecuatorianas, demostrando el tipo,
frecuencia de mutaciones independientes y
sucesivas, que surgen en varias regiones del
gen katG y rpoB; explicando la expresión
fenotípica de resistencia a los fármacos
20
isoniacida y rifampicina
respectivamente.
16,17,18,19
.
La genómica junto
con la historia clínica de los pacientes permite
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correlacionar las cepas y su historia evolutiva
Materiales y métodos
Aislados clínicos
Para el presente estudio se analizaron cepas
del Laboratorio Nacional de Referencia de
Micobacterias del Instituto Nacional de
Investigación en Salud Publica, INSPI,
provenientes de 18 provincias del Ecuador
durante el periodo 2006-2012 aisladas en
medio de Lowenstein Jensen o de Ogawa
Kudoh
32
; de este grupo se tomaron como
referencia tipo control para el estudio
mediante PCR-RFLP y qPCR, los cultivos
positivos identificados como M. tuberculosis,
fueron analizados para determinar la
resistencia a diversas drogas antituberculosas
por el método de las proporciones de Canetti,
Rist y Grosset a las concentraciones
inhibitorias mínimas correspondientes a cada
droga
31,32,33
, rifampicina (40 µg/ml) e
isoniazida (0,2 µg/ml)
46,47
. Se utilizó como
control de calidad la cepa de M. tuberculosis
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de resistencia a drogas
8, 14,15
.
tipo salvaje H37Rv sensible a todos los
medicamentos antituberculosos
23
.
Extracción de ADN
A partir del cultivo se inactivan los aislados
por calentamiento a 90ºC durante 15 minutos
y se procede a la extracción, purificación y
amplificación del ADN mediante PCR
30,34
.
PCR-RFLP
Para detectar mutaciones en el codón 315 del
gen katG de M. tuberculosis, se utilizó la
reacción en cadena de polimerasa (PCR),
acompañada del análisis de polimorfismos de
longitud de fragmentos de restricción (RFLP),
técnica que puede ser utilizada en la rutina
23,32,33
por su sencillez y bajo costo . El
producto amplificado (377 pb) se analizó por
electrophoresis en gel de agarosa al 1,5 %
teñido con Sybergreen y visualizado en
transiluminador
5, 23,36
[1] y sometido a
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digestión con la enzima de restricción MspA1l
(sitio de restricción CMG-CKG).
La enzima de restricción reconoce la
secuencia intacta del segmento de 377 pb
amplificado y es capaz de cortar este en dos
fragmentos con una longitud de 309 pb y 68
pb, pero no es capaz de escindir los
20,
segmentos que presentan la mutación 315
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▼
G(T/G)C▲G(C/A)C
C(A/C)G C(G/T)G
22,24
.
Los patrones de las bandas obtenidas
son analizadas en el equipo de
documentación de geles GelDoc 2000 de
Biorad, con un programa computacional de
análisis de imágenes Quantityone. [2].
Fig. 1 Amplificación gen katG Línea 1 Marcador de peso molecular, línea 2 Agua, línea 3-10 gen
katG amplificado 377 pb
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Fig. 2. PCR-RFLP gen katG. Línea 1
marcador de peso molecular, línea 2 control
H37Rv
cepa salvaje sensible (doble banda), línea 3 y
6 cultivos de MTB sensibles a isoniacida, 4 y
5 cultivos de MTB resistentes a isoniacida
(bandaúnica).
PCR Tiempo Real MTB/RIF
Por recomendaciones de la OPS, la Estrategia
Nacional de Control de la Tuberculosis del
Ecuador realizó la adquisición e incorporación
.
al diagnóstico de MDR. La técnica utilizada
detecta ADN de Mycobacterium tuberculosis
en muestras clínicas y mutaciones del gen
rpoB asociadas a la resistencia a la
rifampicina
34,35
. El ensayo Xpert MTB/RIF
incluye un control de procesamiento de
muestra, supervisa la presencia de inhibidores
a la PCR
36
, comprobación de sonda,
rehidratación de los reactivos y la estabilidad
del fluorocromo [3]. Se realizó un análisis
comparativoconestatécnica
Fig. 3.- Los iniciadores del ensayo Xpert MTB/RIF amplifican una porción del gen rpoB, que
contiene la región "central" de 81 pares de bases. Las sondas son capaces de distinguir entre la
secuencia salvaje conservada y las mutaciones de la región central que se asocian a la resistencia a
RIF.
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Resultados y discusión
Las cepas de Mycobacterium tuberculosis
ingresadas al estudio, analizadas por los dos
métodos fueron por RFLP (40 cepas), PCR
tiempo Real “Genexpert” (346 cepas) y 192
cepas fueron enviadas al Instituto
Supranacional de Chile para la continuación
del estudio en análisis de otras regiones de
resistencia a drogas de primera y segunda
línea un total de 538. [Tabla2].
PROVINCIAS
CEPAS
AZUAY
4
BOLIVAR
3
CAÑAR
2
COTOPAXI
2
CHIMBORAZO
1
EL ORO
22
ESMERALDAS
18
GUAYAS
374
IMBABURA
1
LOJA
1
LOS RÍOS
28
MANABÍ
4
ORELLANA
2
PICHINCHA
30
SANTA ELENA
6
SANTO DOMINGO DE LOS
TSÁCHILAS
2
SUCUMBÍOS
28
TUNGURAHUA
10
TOTAL
538
Tabla 2.- Cepas y procedencia. En esta tabla se detallan las cepas analizadas en este estudio
cultivadas entre los años 2006 al 2012 y su procedencia geográfica.
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PCR-RFLP
El análisis mediante RFLP del gen katG
asociado a la resistencia a isoniacida por
cortes con enzima de restricción MspA1l en
40 cepas de Mycobacterium tuberculosis, 32
con historial de tratamiento previo y 8
pacientes sin tratamiento previo, dio como
resultado lo siguiente:
Doble banda por cortes debido al
reconocimiento de la secuencia intacta de la
enzima en 23 cepas susceptibles a isoniacida y
3 cepas susceptibles a isoniacida, pero
resistente a otros antifímicos.
Banda única por no ser capaz de reconocer y
escindir los segmentos que presentan la
mutación 315 del gen katG en 2 cepas
resistentes a isoniacida, 8 cepas resistentes a
isoniacida que son MDR, 1 cepa resistente a
isoniacida NO MDR, pero además resistente a
otros antifímicos.
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3 cepas resistentes a isoniacida MDR
presentaron doble banda, es decir, la
secuencia del gen katG se encontraba intacta,
lo que indicaría que la resistencia a isoniacida
podría estar relacionada con mutaciones en
otra región del gen o que otro mecanismo
diferente es responsable de esta [Tabla3].
De acuerdo con lo anterior, la detección de la
mutación en el gen katG como estrategia para
la identificación de cepas de M. tuberculosis
resistentes a isoniacida mostró una
sensibilidad de 100 %, una especificidad de
79 %, un valor predictor positivo de 90 % y
un valor predictor negativo de 100 % parecida
a la encontrada en Venezuela
23
, estudio que
exhibió una sensibilidad de 88,24 %, una
especificidad de 100 %, un valor predictor
positivo de 100 % y un valor predictor
negativo de 92 %.
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TÉCNICA: RFLP
TÉCNICA:
PSD
gen
2
BANDAS
PROPORCIONES
katG
SENSIBLE=
1 BANDA
NO
RESISTENTE=
MUTACIÓN
MUTACIÓN
SENSIBLES A HRSEZ
23
23
RESISTENTE H
2
2
RESISTENTE H-R
4
2
2
RESISTENTE H-R-S
4
4
RESISTENTE H-R-S-Z
1
1
RESISTENTE H-R-S-E-
Z
2
2
RESISTENTE H-E-Z
1
1
RESISTENTE R-Z
2
2
RESISTENTE S
1
1
TOTAL
40
29
11
Tabla 3.- Análisis de 40 cepas de M. tuberculosis por RFLP del gen katG por cortes con enzima de
restricción MspA1l
H=Isoniacida, R=Rifampicina, S=Estreptomicin, E= Etambutol, Z= Pirazinamida)
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PCR Tiempo Real
En la técnica por PCR Tiempo Real se analizó
un total de 346 cepas, 232 provenían de
pacientes con un historial de tratamiento
previo y 114 correspondieron a pacientes sin
tratamiento previo.
De 284 cepas sensibles a rifampicina, según la
técnica de proporciones, 275 dieron como
resultado Resistencia RFM no detectada y 9
Resistencia a RFM detectada. La técnica de
PCR tiempo real es considerada más sensible
y específica que la técnica de proporciones y
esto explicaría por qué la técnica de
proporciones aún no la detecta; estudios
similares detectaron mediante evaluación la
presencia de resistencia a la rifampicina falsa
positiva en Xpert MTB / RIF
50
. En Ecuador
por la alta incidencia de tuberculosis resistente
una vez detectado por Genexpert la resistencia
a rifampicina se ingresa inmediatamente al
paciente a tratamiento estandarizado para
MDR
51
.
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En 56 cepas resistentes a rifampicina MDR,
las 56 cepas dieron resistencia a rifampicina
detectada.
En 6 cepas resistentes a rifampicina y sensible
a los otros fármacos, los resultados dieron en
4 cepas resistencia a RFM detectada y en 2
cepas resistencia a RFM no detectada, lo que
indicaría una posible mutación en otra región
genética. [Tabla 4]
De acuerdo con lo indicado, la detección de la
mutación en el gen rpoB como estrategia para
la identificación de cepas de M. tuberculosis
resistentes a rifampicina mostró una
sensibilidad de 96,8 %, una especificidad de
96,7 %, un valor predictor positivo de 99,2 %
y un valor predictor negativo de 100 % similar
a la encontrada en las comunidades Siria y
Libanesa
38
, estudio que mostró que la gran
mayoría (95 %) de los aislados estudiados
contenían mutaciones en los codones 531 y / o
533 correspondientes a la región de 81 pares
de bases del gen rpoB.
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TÉCNICA: PCR TIEMPO REAL
MTB/RIF
RESISTENCIA
A
RESISTENCIA
TÉCNICA:
PSD
PROPORCIONES
RFM NO
A RFM
rpoB
DETECTADA
DETECTADA
227
224
3
SENSIBLE RFM
SENSIBLE
A
RFM
RESISTENTE A
OTROS
57
51
6
RESISTENTE RFM -
6
2
4
SENSIBLE AL RESTO
RESISTENTE RFM -
56
0
56
MDR
RESISTENTE
RFM
NO
MDR RESISTENTE A
OTROS
0
0
0
Tabla 4.- Análisis de 346 cepas de M. tuberculosis por PCR tiempo Real Genexpert MTB/RIF
Conclusiones
La alta prevalencia de las mutaciones en la
región de codón katG y rpoβ en las cepas
MDR-TB indica el potencial que podrían
tener estas pruebas de diagnóstico rápido para
la detección de la resistencia a estas drogas en
M. tuberculosis.
En las cepas resistentes a INH, se observaron
3 cepas resistentes a isoniacida MDR no
presentaron mutaciones en el gen katG por
observarse la doble banda y que pueden estar
asociadas a otros genes, identificados en
estudios previos como los genes ahpC, kasA y
ndh
42, 43
o que otro mecanismo diferente es
responsable de esta resistencia.
Los mecanismos de resistencia a RIF están
basados en cambios estructurales de la ARN
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polimerasa, sugiriendo que la región de la
subunidad β de la enzima juega un rol
importante en determinar el fenotipo de
resistencia. Se observan para la mayoría de los
aislados resistentes a RIF
39, 40, 41
, mutaciones
especialmente en áreas con alta incidencia de
MDR- Tb. En 2 cepas resistentes a RIF no se
detectaron mutaciones en la región del gen rpoβ
analizadas por PCR Tiempo Real Genexpert
MTB/RIF. Este resultado indica que la
resistencia a RIF en estas cepas, podría estar
relacionado con mutaciones en otra región del
gen rpoβ o que otro mecanismo
diferente es responsable de esta resistencia
40,
41.
Como la disminución en la permeabilidad
de la pared celular o bien a mecanismos de
bombas de eflujo
43, 44,45
de drogas activas,
secuestro e inactivación de la droga.
Los estudios realizados a nivel internacional
sobre la resistencia fenotípica con mutaciones
en los genes rpoβ y katG han demostrado una
correlación de 90 % para la resistencia a
rifampicina y de 82,24 % para la resistencia a
isoniazida. Nuestros resultados demostraron
una correlación similar entre la resistencia
fenotípica a rifampicina e isoniazida y las
mutaciones encontradas en los genes rpoβ
(91,6 %) y katG (90,3 %) en cepas
ecuatorianas de M. tuberculosis
23,46,47
.
Recomendaciones
Este estudio nos provee datos valiosos,
incrementa nuestro entendimiento de los
mecanismos moleculares de la resistencia a
drogas y orienta respecto al uso de las técnicas
de susceptibilidad a drogas, basadas en la
detección de diferentes tipos de mutaciones
que ocurren en las cepas ecuatorianas de M.
tuberculosis. Sin embargo, no se puede
descartar que cepas que no posean estas
mutaciones sean resistentes a estos fármacos,
con esta consideración se debe realizar una
investigación de otros genes causantes de
resistencia a estos y a otros fármacos,
especialmente a los de segunda línea,
considerando que en el país desde el año 2010
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se han presentado casos XDR
(extensivamente drogorresistente).
Agradecimiento
Los ensayos fueron apoyados por el Instituto
de Salud Pública de Chile. Damos las gracias
al equipo técnico y administrativo del ISP
Chile, especialmente a los PHD Jorge
Fernández y Pamela Araya y al personal del
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Laboratorio de Referencia de tuberculosis del
Ecuador en el INSPI, a su red a nivel
nacional, especialmente a la Dra. Dolores
Kuffó MsC, Dra. Herlinda Villamar, Dra.
Libia Aveiga y a la PhD Virna Cedeño,
revisora del artículo, así como a todo el
equipo de Concepto Azul con atención
especial a PHD Eric Mialhe por su ayuda y
orientación.
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