Manual para la
Vig
ilancia
de la
R
esistencia
a los Insecticidas en el
E
cuador
2019
INSTITUTO N#C!ONAL DE INPESTIGACION
EN SALUD PUBLICS INSPI - DR. LEOPOLDO IZ@UET# PEREZ
SALUD PUBLICS
GOBIERNO
DE TODOS
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
2
Autoridades del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr.
Leopoldo Izquieta Pérez
Dra. Tania Mori, Directora Ejecutiva
Dra. Sarita Berrones, Coordinadora General Técnica
Dra. Mayra Wilca, Coordinadora Zonal 9
Equipo de redacción y autores
MSc. Diego Morales V. Responsable del Centro de Referencia Nacional de Vectores,
Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta Pérez.
Lic. Paúl Quinatoa, Analista Técnico del Centro de Referencia Nacional de Vectores,
Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta Pérez.
Equipo de colaboradores
Lcda. Maribel Albuja, Analista Técnico del Centro de Referencia Nacional de
Vectores, Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta
Pérez
Lcdo. Roberto Kaslin, Analista Técnico del Centro de Referencia Nacional de
Vectores, Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta
Pérez
Lcdo. Dino Sánchez, Analista Técnico del Centro de Referencia Nacional de
Vectores, Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta
Pérez
Tlga. Paulina Ulloa, Analista Técnico del Centro de Referencia Nacional de Vectores,
Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública - Dr. Leopoldo Izquieta Pérez
Equipo de revisión y validación
Dra. Sarita Berrones, Coordinadora General Técnica
Dr. Manuel González, Director Técnico de Laboratorios de Vigilancia Epidemiológica
y Referencia Nacional
Edición general
Dirección Nacional de Normatización
Dirección de Fomento y Transferencia del Conocimiento. Instituto Nacional
de Investigación en Salud Pública INSPI “Dr. Leopoldo Izquieta Pérez”
Dra. Angélica Mirella Rivera Guapulema
Editor General de la revista científica INSPILIP del Instituto Nacional de Investigación
en Salud Pública INSPI “Dr. Leopoldo Izquieta Pérez”
Lcdo. Patricio Vega Luzuriaga, Mgs.
Publicado en 2020
DOI: 10.31790/inspilip.v3i2.89.g164
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
3
Tabla de contenido
Glosario de términos ................................................................................................ 6
Introducción ............................................................................................................. 7
Antecedentes y justificación ..................................................................................... 7
Objetivo general ....................................................................................................... 8
Objetivos específicos ............................................................................................... 8
Alcance .................................................................................................................... 8
1. Resistencia a los insecticidas ............................................................................ 8
1.1 Método de acción de los insecticidas ......................................................... 8
1.2 Mecanismos de resistencia ........................................................................ 9
1.2.1 Alteración del sitio de acción ............................................................... 9
1.2.2 Resistencia metabólica ..................................................................... 10
1.3 Tipos de resistencia a los insecticidas ...................................................... 10
1.3.1 Resistencia cruzada .......................................................................... 10
1.3.2 Resistencia múltiple .......................................................................... 11
2. Metodologías para la evaluación de resistencia a los insecticidas ................... 11
3. Botella impregnada CDC ................................................................................. 11
3.1 Materiales y reactivos .............................................................................. 11
Materiales ........................................................................................................... 11
Reactivos ............................................................................................................ 11
Material biológico ................................................................................................ 11
3.2 Procedimientos ........................................................................................ 12
3.2.1 Preparación del material biológico..................................................... 12
3.2.2 Preparación de materiales y reactivos ............................................... 12
3.2.3 Limpieza y secado de las botellas antes del recubrimiento ............... 12
3.2.4 Rotulado de botellas ......................................................................... 12
3.2.5 Recubrimiento de botellas ................................................................. 13
3.2.6 Ensayo biológico ............................................................................... 14
3.3 Interpretación de resultados ..................................................................... 15
3.4 Validez de los resultados ......................................................................... 16
4. Metodología del papel impregnado OMS............................................................ 16
4.1 Materiales y reactivos .............................................................................. 16
Material biológico ................................................................................................ 17
4.2 Procedimientos ........................................................................................ 17
4.2.1 Preparación de materiales y reactivos ............................................... 17
4.2.2 Limpieza y secado del material ......................................................... 17
4.2.3 Ensayo biológico ............................................................................... 17
4.3 Interpretación de resultados ..................................................................... 20
4.4 Validez de los resultados ......................................................................... 20
5. Bioensayos de estadios inmaduros ................................................................. 20
5.1 Materiales y reactivos .............................................................................. 21
Materiales ........................................................................................................... 21
Reactivos ............................................................................................................ 21
Material biológico ................................................................................................ 21
5.2 Procedimientos ........................................................................................ 21
5.2.1 Preparación del material biológico..................................................... 21
5.2.2 Preparación de materiales y reactivos ............................................... 21
5.2.3 Limpieza y secado de materiales ...................................................... 21
5.2.4 Rotulado de vasos de exposición ...................................................... 22
5.2.5 Ensayo biológico ............................................................................... 22
5.3 Interpretación de resultados ..................................................................... 23
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
4
5.4 Validez de los resultados ......................................................................... 24
6. Ingreso al sistema informático SIRI ................................................................. 24
6.2 Ingreso de datos metodología de la botella impregnada CDC y OMS ....... 26
6.3 Validación de resultados .......................................................................... 28
Bibliografía ............................................................................................................. 29
Anexos ................................................................................................................... 31
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
5
Índice de figuras
Figura 1. Etiquetado de botellas
impregnadas…………………………………….....
13
Figura 2. Colocación de
insecticida…………………………………………………...
13
Figura 3. Impregnación de insecticida en tapa de
botella…………………………..
13
Figura 4. Impregnación de botella en
paredes……………………………………….
14
Figura 5. Secado de botellas y rotación de
insecticida……………………………...
14
Figura 6. Ingreso de mosquitos en botellas
impregnadas…………………………..
15
Figura 7. Metodología de papel
impregnado…………………………………………
18
Figura 8. Colocación del papel de
mantenimiento…………………………………...
19
Figura 9. Ingreso de mosquitos al tubo de
reposo…………………………………..
19
Figura 10. Preparación de tubos con
insecticida…………………………………….
19
Figura 11. Exposición de
mosquitos…………………………………………………..
19
Figura 12. Etiquetado de vasos de
exposición……………………………………….
22
Figura 13. Medición de las cantidades de
agua……………………………………...
23
Figura 14. Colocación de dosis de
insecticidas………………………………………
23
Figura 15. Colocación de estadios
inmaduros……………………………………….
23
Figura 16. Exposición de larvas al
insecticida………………………………………..
23
Figura 17. Pantalla de inicio sistema
SIRI…………………………………………….
25
Figura 18. Opciones de pruebas de resistencia
SIRI………………………………..
25
Figura 19. Georreferenciación sistema
SIRI………………………………………….
26
Figura 20. Opciones de ingreso, bioensayo
CDC……………………………………
27
Figura 21. Opciones de ingreso, bioensayo
OMS…………………………………...
27
Figura 22. Opciones de ingreso de réplicas, bioensayo
OMS……………………...
27
Figura 23. Opciones de ingreso, bioensayo OMS
inmaduros………………………
28
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
6
Índice de tablas
Tabla 1. Mecanismos de resistencia a insecticidas ................................................ 10
Tabla 2. Valoraciones de mortalidad ...................................................................... 23
Glosario de términos
Alelos: cada una de las dos o más versiones de un gen, los cuales son heredados
por los progenitores para cada gen autosoma. De forma muy simplificada, se puede
distinguir entre los llamados alelos normales, o los mutantes, si han sufrido alguna
alteración que hace que su secuencia haya cambiado.
Canal de sodio: son proteínas transmembranales que permiten el paso de iones de
sodio a través de la membrana celular (intercambio de sustancias).
Dosis diagnóstica: concentración de insecticida que, combinada con un tiempo de
exposición predefinido, se utiliza para determinar las proporciones de fenotipos
susceptibles y resistentes dentro de una muestra de una población de mosquitos.
Fenotípica: rasgos particulares y genéticamente heredados de cualquier organismo
que lo hacen único e irrepetible en su clase; se relaciona principalmente a elementos
físicos y morfológicos de cada individuo.
Génico: perteneciente o relativo a los genes (característico).
Impregnación: técnica que consiste en recubrir un objeto.
Iones: átomos o grupos de átomos que tienen una carga eléctrica.
Patógeno: agente biológico externo que se aloja en un organismo biológico
determinado, dañando o afectando su integridad a partir de enfermedades.
Progenie: descendencia directa de un ser vivo en una generación.
Punto diana: sitio de acción específico.
Silente: eferente a las mutaciones silenciosas, que no se expresan.
Toxicidad: capacidad de una sustancia química de producir efectos perjudiciales
sobre un ser vivo.
Xenobióticos: compuestos cuya estructura química en la naturaleza es poco
frecuente o inexistente, debido a que son compuestos sintetizados por el hombre en
el laboratorio.
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
7
Introducción
Las enfermedades transmitidas por vectores (ETV) son enfermedades en las cuales
un vector biológico tiene la capacidad de transportar y transmitir un patógeno a otro
organismo
(1)
; principalmente causadas por parásitos, virus y bacterias. Entre los
principales vectores tenemos a mosquitos, flebótomos, chinches triatomíneos,
simúlidos, garrapatas, moscas, ácaros, caracoles y piojos
(2)
.
Aproximadamente cada año se reportan más de 700.000 defunciones a nivel mundial
debido a enfermedades como paludismo, dengue, esquistosomiasis, tripanosomiasis
africana humana, leishmaniasis, enfermedad de Chagas y fiebre amarilla, afectando
principalmente a las poblaciones más pobres, ubicadas en zonas tropicales y
subtropicales
(2)
. En el Ecuador se ha notificado la presencia de varias arbovirosis
como: dengue, zika, chikunguña, fiebre amarilla y fiebre Mayaro, las cuales debido a
sus ciclos de transmisión selvática y urbano son de importancia médica. El cambio
climático, factores ecosistémicos y sociodemográficos han contribuido a la
distribución de vectores de la familia Culicidae, como Aedes aegypti, Ae. albopictus,
Haemagogus y Anopheles, involucrados en la transmisión activa de enfermedades
vectoriales, afectando a poblaciones urbanas, urbano-marginales y rurales asentadas
en áreas de clima tropical y subtropical, que representan aproximadamente un 70 %
de la extensión territorial del país
(3)
.
El control de los vectores ha constituido una estrategia fundamental para la
prevención y de las arvobirosis a nivel mundial, principalmente con el uso de
insecticidas y la destrucción de criaderos mediante la participación comunitaria. El
control químico ha sido la principal actividad durante varios años, logrando la
erradicación de dengue en 22 países de Latinoamérica, entre los años de 1948 a
1962 mediante el uso del DDT
(4)
. Sin embargo, este compuesto presentó un alto nivel
de toxicidad en organismos acuáticos, vertebrados e invertebrados y el desarrollo de
resistencia en las poblaciones de Ae. Aegypti, ocasionado así un incremento de
casos por dengue desde el año 1980
(4,5)
. Actualmente se reporta la resistencia
cruzada a insecticidas piretroides como deltametrina, alfacipermetrina como
consecuencia del uso intensivo del DDT en México, Perú, Cuba, Colombia, Brasil,
Argentina y Venezuela
(6-10)
.
En el Ecuador, el monitoreo de resistencia a los insecticidas se ha realizado desde el
año 2016, con el reporte de resistencia a deltametrina en cinco provincias y la
susceptibilidad a malatión
(11)
. En el año 2019 el Instituto Nacional de Investigación en
Salud Publica INSPI, a través del Centro de Referencia Nacional de Vectores, realizó
un monitoreo de la resistencia a insecticidas en poblaciones de Ae. aegypti
reportando la resistencia a temefos y malatión, organofosforados utilizados para el
control de poblaciones de vectores
(12,13)
. Estos resultados indican la importancia de
realizar un monitoreo continuo de las poblaciones de vectores a nivel nacional para
planificar las estrategias de control y el manejo de resistencia a insecticidas.
Antecedentes y justificación
En la actualidad no existe un tratamiento específico o vacunas disponibles contra el
zika, dengue y chikunguña, siendo las actividades de control vectorial las principales
estrategias disponibles para prevenir y reducir el impacto de enfermedades
(14)
.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Centro para el Control y Prevención
de Enfermedades (CDC) han desarrollado metodologías de evaluación para
poblaciones de Ae. aegypti y Anopheles spp, con el fin de intensificar la vigilancia de
la resistencia de insecticidas en cada uno de los países de la región y mantener
actualizada la información de resistencia fenotípica y sus mecanismos de
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
8
resistencia
(15)
. Con la detección de resistencia a insecticidas piretroides y
organofosforados, se hace indispensable la vigilancia periódica de las poblaciones
de vectores en el Ecuador, que permitan orientar las intervenciones de control
vectorial.
Actualmente como parte de las estrategias de prevención y control, se ha incorporado
la Red Nacional de Laboratorios de Entomología, con seis laboratorios en la región
Litoral, tres laboratorios en la región Amazónica, un laboratorio en la región Insular y
un laboratorio de referencia nacional, los cuales realizan el monitoreo continuo de
resistencia a insecticidas en vectores de importancia médica y la evaluación operativa
de metodologías de control vectorial. Estos resultados permitirán adoptar
sistemáticamente una metodología de estratificación, focalizar intervenciones en
áreas críticas y la implementación de nuevas estrategias a partir de criterios técnicos.
Objetivos
Objetivo general
Establecer los procedimientos estandarizados para la realización de pruebas de
resistencia a los insecticidas en Aedes aegypti y Anopheles spp. en los laboratorios
de la Red Nacional de Laboratorios de Entomología.
Objetivos específicos
Estandarizar el ingreso de información de resistencia a los insecticidas en el sistema
en línea, para garantizar los resultados y monitorear el estado de las poblaciones a
nivel nacional.
Alcance
Este modelo se aplicará a toda la Red de Laboratorios de Entomología del Ministerio
de Salud Pública, anclados a las Coordinaciones Zonales de Salud, de acuerdo con
la organización y distribución territorial establecida.
El Centro de Referencia Nacional de Vectores es el laboratorio de referencia nacional
y será el encargado de liderar, revisar, analizar, supervisar y aprobar las actividades
realizadas por los laboratorios de entomología.
Capítulo 1
1.
Resistencia a los insecticidas
La resistencia está definida por la capacidad que presentan los insectos para
sobrevivir a la exposición de una determinada dosis de insecticida, debido a factores
fisiológicos o adaptativos. En muchos de los casos la aparición de resistencia se
genera por un factor evolutivo, inducido por una conducta de evasión o por el
desarrollo de mecanismos de resistencia
(16)
.
1.1
Mecanismos de acción de los insecticidas
Actualmente se registra un total de 25 grupos de insecticidas y acaricidas, entre los
cuales los principales grupos recomendados por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) para las actividades de control vectorial son: organoclorados (OC),
organofosforados (OP), carbamatos (CA) y piretroides (PY)
(17)
. Todas estas clases
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
9
de insecticidas actúan en el sistema nervioso central de los insectos, mediante varios
mecanismos de acción.
Los insecticidas organofosforados y carbamatos tienen como punto de acción la
acetilcolinesterasa (AChE), la cual es una enzima del sistema nervioso central,
encargada de realizar la degradación hidrolítica de la acetilcolina en la sinapsis
nerviosa y provoca la interrupción del impulso nervioso.
Los insecticidas piretroides y organoclorados, su punto de acción se encuentra en los
canales de sodio, los cuales se mantienen abiertos generando la afluencia continua
de iones a través de los axones nerviosos. Como resultado de la acción de
insecticidas OP, OC, PY y CA en el sistema nervioso central, se observa la parálisis,
convulsiones y muerte de los individuos expuestos
(17,18)
.
1.2
Mecanismos de resistencia
La resistencia a insecticidas se encuentra influenciada por factores genéticos,
biológicos y operacionales, los cuales permiten sobrevivir a los individuos a la
exposición de los insecticidas. El factor genético se relaciona con el aumento de la
frecuencia y dominancia de los alelos de resistencia presentes en la población; el
factor biológico influenciado por el ciclo de vida, la alta fecundidad y las tasas de flujo
génico de las poblaciones, y el factor operacional representado por la aplicación
continua de los insecticidas en las intervenciones de control vectorial
(18,19)
. Estos
factores con el tiempo, dosis, formulación y selección del químico ejercen una presión
selectiva provocando el desarrollo de mecanismos de resistencia.
Se han identificado varios mecanismos de resistencia a los insecticidas, entre los
cuales se encuentran el cambio de comportamiento, la penetración alterada en la
cutícula, la modificación del sitio de acción y la resistencia metabólica. Los dos
primeros mecanismos han sido poco investigados y no se encuentran reportes
disponibles para mosquitos, sin embargo, la resistencia metabólica y la modificación
del punto de acción se han descrito ampliamente y se encuentran involucrados en la
resistencia a los insecticidas
(17,19)
.
1.2.1
Alteración del sitio de acción
Este mecanismo de acción se encuentra relacionado con la presencia de mutaciones
puntuales no silentes en genes estructurales. La mutación selecciona favorablemente
el cambio de aminoácidos, los cuales provocan alteraciones estructurales en la
proteína diana, alterando los niveles de toxicidad de los insecticidas sin causar
pérdida de la función primaria del sitio de acción. El costo de la eficacia biológica
tiene importante implicación para la persistencia de resistencia y/o reversión a la
susceptibilidad en poblaciones de campo
(18,19)
.
Canales de sodio dependientes de voltaje (kdr)
La resistencia kdr o knockdown confiere mutaciones puntuales en el canal de
voltaje de sodio (1 016Val + 1 534Phe ) (1 016Val + 1 534Cyskdr) y (1
016Ilekdr + 1 534Cyskdr) para tolerar dosis a insecticidas piretroides
(deltametrina) y organoclorados (DDT), los cuales actúan directamente sobre
el sistema nervioso
(18,19)
.
Acetilcolinesterasas (AchE)
Este mecanismo es el principal punto de acción para insecticidas
organofosforados (malatión) y carbamatos, los cuales inhiben la actividad
enzimática mediante fosforilación en el punto de acción. Las mutaciones
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
10
involucran sustituciones de aminoácidos en el sitio activo de la enzima
provocando los niveles de insensibilidad a insecticidas
(19)
.
1.2.2
Resistencia metabólica
La resistencia metabólica es el resultado del incremento en la expresión de genes
codificadores de enzimas que metabolizan a los principales xenobióticos. Se
encuentra relacionada con el aumento de actividad enzimática principalmente de tres
familias de enzimas: carboxilesterasas, glutation S-transferasas (GST) y
monooxigenasas. Este mecanismo se caracteriza por una ganancia en la capacidad
para desintoxicar moléculas de insecticidas, evitando que lleguen a sus objetivos
(19)
.
Carboxilesterasas
Estas enzimas se han asociado como mecanismo de resistencia a
organofosforados (malatión), carbamatos y en menor proporción a piretroides
(deltametrina). Las esterasas actúan uniéndose rápidamente al insecticida,
secuestrando las moléculas antes de que lleguen a su sitio de acción
(18,19)
.
Glutation-S-transferasas
Este mecanismo se asocia principalmente con resistencia a DDT,
organofosforados y recientemente piretroides, a través de mecanismos de
cambio en la especificidad del sustrato, provocando niveles elevados de
actividad enzimática y regulación génica
(19)
.
Citocromos P450
Se ha relacionado a este mecanismo en casi todas las clases de insecticidas,
principalmente piretroides y organoclorados
(19)
.
Tabla 1. Mecanismos de resistencia a insecticidas
Mecanismos de resistencia
Punto de acción
Metabólico
KDR
Acetilcolin
esterasas
Carboxile
sterasas
Glutation-
S-
transferasa
s
Mono-
oxigenasa
s
Piretroides
DDT
Carbamatos
Organofosforados
Fuente: Adaptado de Global report on insecticide resistance in malaria vectors: 2010–2016
1.3
Tipos de resistencia a los insecticidas
1.3.1
Resistencia cruzada
Este tipo de resistencia involucra el mismo mecanismo de resistencia para dos clases
de insecticidas, debido a que productos de insecticidas de un mismo grupo químico
suelen afectar a un punto de acción en común, por lo que se considera que
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
11
comparten un mismo modo de acción. Este tipo de resistencia se presenta
generalmente en los insecticidas piretroides y organoclorados
(19,20)
.
1.3.2
Resistencia múltiple
La resistencia múltiple involucra la presencia de diferentes mecanismos en una
misma población de insectos. Un individuo desarrolla resistencia a dos a más
insecticidas de diferente modo de acción, por el desarrollo de varios mecanismos de
resistencia
(20)
.
Capítulo 2
2.
Metodologías para la evaluación de resistencia a los
insecticidas
La detección de resistencia a insecticidas se encuentra basada en pruebas
sencillas de dosis – respuesta, en las cuales se obtiene como resultado la
determinación de susceptibilidad o resistencia de una población expuesta.
Actualmente la OMS y el CDC han desarrollado varias metodologías para la
evaluación de resistencia en individuos adultos e inmaduros, las cuales han permitido
distinguir los diferentes niveles de susceptibilidad. Estas metodologías son
herramientas de vigilancia en laboratorio y campo, siendo el punto inicial de
posteriores estudios para la determinación de mecanismos de resistencia.
3.
Botella impregnada CDC
Esta metodología se encuentra definida por el tiempo que tarda un insecticida
en ingresar al mosquito, alcanzar su sitio blanco y actuar sobre el mismo; de esta
manera la información obtenida proporciona evidencia inicial, de que un insecticida
está perdiendo su efectividad en una población de vectores. Esta metodología puede
ser realizada en poblaciones colectadas en campo o en poblaciones criadas en
laboratorio a partir de larvas.
3.1
Materiales y reactivos
Materiales
• Botellas de vidrio tipo Wheaton de 250 ml.
• Micropipeta y puntas descartables.
• Aspirador manual para mosquitos.
• Envases de transferencia de mosquitos.
• Cronómetro digital.
• Marcador indeleble para rotular.
• Cinta adhesiva para etiquetar.
• Guantes desechables.
• Lápiz y borrador.
• Ficha de registro.
Reactivos
• Insecticidas a ser evaluados, grado técnico o formulaciones.
• Acetona o etanol absoluto de grado analítico.
Material biológico
• Mosquitos de los géneros Aedes o Anopheles
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
12
3.2
Procedimientos
3.2.1
Preparación del material biológico
Los mosquitos que se utilizarán en el bioensayo deberán ser obtenidos en laboratorio
a partir de larvas hasta la filial F1 o capturados en campo como adultos; se
recomienda una cantidad de 100 mosquitos en cada prueba, los cuales deberán estar
alimentados previamente con una solución azucarada al 10 %. Cuando no sea
posible disponer del número suficiente de mosquitos, se pueden combinar los
resultados con múltiples ensayos biológicos de días diferentes, para lograr el tamaño
de muestra recomendada.
Se utilizarán únicamente mosquitos hembras para la realización de bioensayos y los
individuos no deben estar alimentados con sangre.
Consideraciones de campo
Cuando se realicen bioensayos en condiciones de campo es importante
realizar la identificación taxonómica de las especies, después de haber
terminado la prueba, de esta manera se pueden validar los resultados. Se
considerará válida la prueba cuando se obtenga un 95 % de predominancia
de una especie después de haber realizado la identificación.
3.2.2
Preparación de materiales y reactivos
Todo el material utilizado en el bioensayo deberá estar seco y limpio para su uso y
los reactivos deberán encontrarse a temperatura ambiente, con fecha de caducidad
vigente para ser utilizados.
3.2.3
Limpieza y secado de las botellas antes del recubrimiento
Las botellas deberán lavarse con abundante agua jabonosa con la ayuda de un
cepillo, pasando por los bordes de la botella; el enjuague podrá ser realizado con
agua corriente. Para secar las botellas se deberán dejar destapadas a temperatura
ambiente o bajo el sol, en el caso de ambientes húmedos se pueden dejar toda la
noche o el tiempo que sea necesario. En el caso que se disponga de un horno (estufa)
se puede dejar durante 15 a 20 minutos observando que estén completamente secas.
NOTA: Tener cuidado con la limpieza y secado de las botellas después de la
finalización del ensayo biológico para evitar la presencia de trazas de insecticida que
podrían interferir en futuros ensayos. Para asegurar un procedimiento adecuado de
limpieza se puede introducir algunos mosquitos susceptibles, los cuales no deben
morir de inmediato; en caso de que esto suceda, se debe repetir el procedimiento de
lavado, secado y realizar una nueva prueba con mosquitos.
3.2.4
Rotulado de botellas
Las botellas deberán ser rotuladas con cinta adhesiva, debido a que se utilizarán en
posteriores bioensayos. Es importante rotular las botellas y las tapas de manera que
cada botella se encuentre asociada con su tapa respectiva, esto permitirá no
confundir las botellas que estén impregnadas con insecticidas con la botella control.
Se recomienda que las botellas tengan rotulada la siguiente información: tipo de
insecticida, número de réplica, concentración del insecticida a utilizar y fecha del
ensayo biológico de acuerdo a la siguiente descripción.
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
13
Figura 1. Etiquetado de botellas impregnadas
Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores
3.2.5
Recubrimiento de botellas
Antes de realizar la impregnación, hay que asegurarse que las botellas se encuentren
completamente secas.
Agregar 1 ml de insecticida, etanol o acetona con la ayuda de una micropipeta o
pipeta desechable. Si se utiliza la micropipeta se deberá cambiar las puntas para cada
sustancia colocada; en el caso que se usen pipetas desechables es importante
etiquetar una pipeta con el término “control” para la botella testigo y otra pipeta con
“solución insecticida” para las botellas de prueba. Después de haber colocado las
sustancias se debe tapar firmemente (fig. 2).
Para que el insecticida o sustancia control quede recubierta completamente en la
botella, es necesario agitar suavemente para recubrir el fondo, invertir la botella para
recubrir el interior de la tapa y rotar de forma horizontal para que el contenido se
distribuya en las paredes de la botella de manera uniforme (fig. 3) (fig. 4).
Cuando haya realizado el procedimiento anterior, deberá quitar las tapas y continuar
rotando las botellas hasta observar que el líquido haya desaparecido y las botellas
estén completamente secas. Se deberán dejar en posición horizontal y cubiertas de
la luz (fig. 5).
Si las botellas no se van a usar de inmediato, deberán ser almacenadas en un lugar
oscuro y fresco con sus respectivas tapas para evitar el ingreso de humedad. Si se
necesita transportar botellas recubiertas con insecticidas al campo, se deberán llevar
completamente tapadas y cubiertas de la luz.
Figura 2. Colocación de insecticida Figura 3. Impregnación de insecticida en tapa de botella
Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores
Deltametrina
Réplica 1
Concentración: 10,46 ppm
Fecha de preparación: 14/10/2019
Responsable: JP
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
14
Figura 4. Impregnación de botella en paredes Figura 5. Secado de botellas y rotación de insecticida
Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores
Consideraciones de campo
Si el procedimiento será realizado en condiciones de campo, es importante
que se mantenga la cadena de frío durante el transporte. En zonas húmedas
la impregnación de las botellas puede dificultarse, debido a las condiciones
climáticas y se recomienda realizar la impregnación en laboratorio. Las
botellas deberán ser transportadas completamente cubiertas de la luz.
NOTA: Las botellas recubiertas podrán ser utilizadas el mismo día para la evaluación
de varios grupos de mosquitos, sin embargo, un factor limitante es la humedad, que
podría acumularse en cada introducción de mosquitos. Las botellas podrán ser
utilizadas entre bioensayos con un intervalo de dos a cuatro horas. El tiempo que se
puede almacenar una botella impregnada es de 24 horas a cinco días, bajo las
condiciones anteriormente descritas; este tiempo puede variar dependiendo del
insecticida y las condiciones de almacenamiento. Se recomienda utilizar botellas con
un máximo de 48 horas después de su impregnación.
Está prohibido secar las botellas después de haber sido recubiertas con
insecticida en el horno.
3.2.6
Ensayo biológico
El ensayo biológico se puede realizar con las botellas paradas o acostadas, lo
importante es seguir siempre el mismo procedimiento.
Con la ayuda de un aspirador o tubo falcón con malla se deberán introducir, en cada
una de las botellas (prueba y control), entre 20 a 25 mosquitos. Tenga precaución al
momento de soplar, debido a que los mosquitos pueden golpearse contras las
paredes y causar mortalidad sin que el insecticida haga su efecto (fig. 6).
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
15
Figura 6. Ingreso de mosquitos en botellas impregnadas
Fuente: Centro de Referencia Nacional de Vectores
Con la ayuda de un cronómetro se deberá contar el número de mosquitos muertos
y/o vivos y serán registrados en el formato correspondiente. Las observaciones en
cada una de las botellas deberán ser realizadas cada 15 minutos hasta que la
totalidad de mosquitos haya muerto o hasta que se cumplan dos horas desde el inicio
de la prueba. No es necesario continuar con el ensayo biológico después de dos
horas. Recuerde que la mortalidad en el tiempo de diagnóstico es el valor más crítico,
ya que representa el límite entre la susceptibilidad y la resistencia (anexo 1).
Se deberá considerar como “muertos” a mosquitos que no puedan mantenerse en
pie, presenten vuelo sin coordinación, errático y/o que no tengan movimiento alguno.
La mortalidad de la botella control al finalizar el bioensayo deberá ser 0 (cero), sin
embargo, si se presentan valores entre el 3 % y 10 %, la mortalidad deberá ser
corregida mediante la fórmula de Abbott. Si la mortalidad de la botella control al final
del bioensayo es >10 %, los resultados deberán ser descartados, posterior a un
análisis técnico.
NOTA: Cuando se realice la introducción de mosquitos con la ayuda del aspirador,
es importante que este no tenga contacto físico con la botella, ya que se podría
contaminar. Se puede rotar suavemente la botella para facilitar el conteo de los
mosquitos. Es más fácil contar el número de mosquitos muertos en las primeras
lecturas del ensayo biológico y contar los mosquitos vivos en mediciones posteriores.
Recuerde que el número de mosquitos en cada una de las botellas no tiene que ser
igual, pero se debe conocer el número inicial de mosquitos.
3.3
Interpretación de resultados
Después de haber registrado las lecturas de mortalidad en las botellas de prueba y
en las botellas de control, los datos se deberán organizar y trasladar a una tabla de
datos y a su vez ingresar al sistema en línea
(http://www.vectores.inspi.gob.ec/inspi/contenido.xhtml).
El criterio propuesto por la Organización Mundial para la Salud (OMS) para evaluar
los valores de resistencia es:
• Si la mortalidad calculada se encuentra entre 98 % y 100 % en el tiempo de
diagnóstico, indica susceptibilidad en la población evaluada;
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
16
• Una mortalidad entre 80 %–97 % en el tiempo de diagnóstico, sugiere la
posibilidad de resistencia y debe ser confirmada;
• Un valor calculado <80 % de mortalidad en el tiempo de diagnóstico, sugiere
resistencia en la población evaluada.
NOTA: Los casos donde se detectó una mortalidad <95 % en el tiempo de
diagnóstico, en ensayos biológicos que han sido conducidos en condiciones óptimas
y con un tamaño de muestra de >100 mosquitos, sugerirían fuertemente la presencia
de resistencia.
3.4
Validez de los resultados
Al finalizar el bioensayo, la mortalidad de los mosquitos de la botella control debe ser
cero o < 10 %. Si el valor de mortalidad es mayor, es necesario repetir el bioensayo,
sin embargo, si un grupo de mosquitos es esencialmente irreemplazable y el ensayo
biológico no puede ser repetido, la fórmula de Abbott puede ser considerada aun
cuando la mortalidad del control sea > 10 %.
La fórmula de mortalidad corregida es la siguiente:
(
𝑚
𝑜
𝑟𝑡𝑎
𝑙𝑖𝑑𝑎
𝑑
𝑒
𝑛
𝑏
𝑜
𝑡𝑒
𝑙𝑙𝑎
𝑠
𝑝
𝑟𝑢𝑒
𝑏
𝑎
%
−
𝑚
𝑜
𝑟𝑡𝑎
𝑙
𝑖𝑑𝑎
𝑑
𝑒
𝑛
𝑏
𝑜
𝑡𝑒
𝑙𝑙𝑎
𝑠
𝑐
𝑜
𝑛
𝑡𝑟𝑜
𝑙
%
)
𝑥
100
𝑀𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎
=
(100 %
−
𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑒𝑛
𝑏𝑜𝑡𝑒𝑙𝑙𝑎𝑠
𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
%)
Por ejemplo: si la mortalidad en las botellas de exposición es del 50 % en el tiempo
de diagnóstico y la mortalidad en el control es del 10 % al finalizar el bioensayo, la
mortalidad corregida será: [(50 %-10 %) / (100 %-10 %)] x 100 = 44,4 %.
4.
Metodología del papel impregnado OMS
Esta metodología es una prueba de respuesta directa a la exposición de una
concentración estándar, en un tiempo definido. La funcionalidad de esta metodología
es distinguir entre el nivel de susceptibilidad y la resistencia a insecticidas en
mosquitos adultos. A diferencia de la metodología de la botella impregnada, la OMS
ha desarrollado un kit de evaluación mediante la impregnación de dosis de
insecticidas en papeles, los cuales al contacto con los mosquitos permiten obtener
información de la resistencia en las poblaciones evaluadas.
4.1
Materiales y reactivos
• Tubos acrílicos con malla para la evaluación de insecticidas (con punto rojo).
• Tubos acrílicos con malla para el control (con punto amarillo).
• Tubos acrílicos con malla para reposo (con punto verde).
• Aspirador manual para mosquitos.
• Clips.
• Hojas de papel blanco (12 × 15 cm).
• Alambres de cobre.
• Guantes desechables.
• Algodón.
• Cronómetro digital.
• Ficha de registro.
Reactivos
• Papeles impregnados a ser evaluados.
CENTRO DE REFERENCIA NACIONAL DE VECTORES
17
• Papeles impregnados para el control.
Material biológico
• Mosquitos a evaluar
Preparación del material biológico
Se recomienda utilizar hembras adultas obtenidas en laboratorio a partir de larvas
procedentes de campo, sin embargo, cuando no sea posible obtener la cantidad
suficiente de individuos, se recomienda obtener la primera filial (F1) en el laboratorio
y realizar la evaluación de resistencia. Se sugiere que los mosquitos tengan de tres
a cinco días de edad, que no hayan ingerido sangre y alimentados con una solución
azucarada al 10 %.
Consideraciones de campo
Cuando se utilicen individuos de campo se deberán seleccionar y someter a
prueba, únicamente individuos hembras que no se encuentren alimentadas
con sangre; en el caso que no se disponga de otros individuos se puede
proporcionar agua azucarada para que resistan y unas horas antes de la
prueba dejarlas ayunar.
4.2
Procedimientos
4.2.1
Preparación de materiales y reactivos
Todo el material utilizado en el bioensayo debe estar perfectamente limpio y seco
para su uso. Los papeles impregnados deberán encontrarse a temperatura ambiente
y con fecha de caducidad vigente antes de ser utilizados.
4.2.2
Limpieza y secado del material
Los tubos deberán ser lavados inmediatamente después de haber realizado el
bioensayo de resistencia; este procedimiento se deberá realizar con una esponja
suave con detergente o jabón, realizando el secado a temperatura ambiente.
Nota: No utilizar sustancias que contengan alcohol para lavar los materiales, estos
productos deterioran y reducen la vida útil de los mismos.
4.2.3
Ensayo biológico
Antes de realizar el bioensayo se deberá preparar el material que se va a utilizar, hay
que tener en cuenta que se deberá realizar la exposición de 100 a 125 mosquitos; si
no se dispone de esa cantidad, se pueden realizar varios bioensayos para completar
la cantidad necesaria. En cada bioensayo realizado se debe utilizar un grupo control.
Se debe colocar una hoja de papel blanco de 12 cm x 15 cm enrollada en forma de
cilindro; estos papeles deberán estar sujetados por un clip de alambre dentro de cada
tubo de mantenimiento (marcado con punto verde). Después de observar que el clip
esté correctamente colocado y el papel sin bordes externos, se fijará la unidad
corrediza al extremo de cada tubo.
Con la ayuda de un aspirador manual, los mosquitos deberán ingresar al tubo de
mantenimiento, a través del orificio en la unidad corrediza en grupos de 20 a 25
mosquitos. Los tubos deberán quedar en posición vertical durante una hora en reposo
y se extraerá a los mosquitos que estén moribundos, que presenten incapacidades